Biotemplate und Phagen Display

Phagen Display

Abb. 1: Funktionsweise der Phagen Display Methode.
A) Eine randomisierte Peptidbibliothek wird auf der
Oberfläche von M13 Bakteriophagen exprimiert. Diese
Peptidbibliothek wird mit dem Zielsubstrat inkubiert. Ein Teil
der Phagen bindet aufgrund der biochemischen Eigenschaften
des Peptides spezifisch an das Zielsubstrat.
B) Nicht gebundene Phagen-Peptid Komplexe werden eliminiert.
C) Spezifisch gebundene Phagen werden vom Substrat eluiert
und die Peptidsequenz bestimmt.
Abb. 2:  Anwendungsgebiete von anorganisch-bindenden
Peptiden.

Die Synthese von anorganischen Materialien (z.B. Oxidkeramik) kann durch Peptide gesteuert werden. Um Peptide, die spezifisch an anorganische Materialien binden zu identifizieren wird die Methode des Phagen Displays eingesetzt (Abb. 1). Hierbei wird eine Peptidbibliothek auf der Oberfläche von genetisch modifizierten M13 Bakteriophagen exprimiert. Diese Peptidbibliothek wird mit dem Zielsubstrat inkubiert, wobei ein Teil der Phagen aufgrund der biochemischen Eigenschaften des Peptides spezifisch an das Zielsubstrat bindet. Phagen-Peptid Komplexe, bei denen die Peptide nicht mit dem Zielsubstrat interagieren werden eliminiert und schließlich die Peptid-Phagen Komplexe isoliert, deren Peptide spezifisch mit dem Substrat wechselwirken. Die Peptidsequenz wird über eine Sequenzierung der Phagen DNA bestimmt. Die exakten Bindungsstellen innerhalb eines Peptides werden dann mittels Kernspinresonanzspektroskopie (NMR) bestimmt. Die Bindungsstärke bzw. die Affinität der Peptide zum Substrat wird durch verschiedene Methoden bestimmt. Die Bindungsstärke der Phagen-Peptid Komplexe werden durch Bindungs-Assays bestimmt (Abb. 2), während die Affinität einzelner Peptide durch NMR, Oberflächenplasmonenresonanz, oder Kristallmikro­waagen Experimente bestimmt werden. 

Die identifizierten anorganisch-bindenden Peptide können für verschiedene Anwendungen im Bereich der Materialsynthese eingesetzt werden (Abb. 2). Peptide werden zur Kontrolle der Morphologie bzw. des Polymorphs verwendet [LINK Biomineralisation]. Auf der Oberfläche von Biotemplaten exprimiert (z.B. M13 Phagen, Tabak Mosaik Virus) beeinflussen sie das Mineralisationsverhalten der Templatstrukturen. Technisch relevante 2D und 3D Strukturen können im Nanometerbereich können erzielt werden, wie z.B. M13 Phagen als Nanodrat mit Zinkoxid (ZnO) Beschichtung (Abb. 4).

 

Biotemplate:

Abb. 3: Tabak Mosaik Virus als Biotemplat zur Abscheidung von Zinkoxid.
AFM Aufnahme von TMV/ZnO Hybridstrukturen auf einem Si-Wafer.

Im Laufe der Evolution entwickelte die Natur Verbundmaterialien aus organischen und anorganischen Bestandteilen mit außergewöhnlichen Materialeigenschaften. Diese Materialien, wie z.B. Perlmutt, werden mit Hilfe von Biomolekülen synthetisiert, die entweder als komplexes Templat zur Abscheidung eines anorganischen Materials oder als strukturgebende Einheit dienen. Von diesen natürlichen Bildungsmechanismen inspiriert, wurden hier am Lehrstuhl verschiedene Synthesemethoden entwickelt, die die Bildung von technisch relevantem Materialien wie Zinkoxid (ZnO) unter moderaten Reaktionsbedingungen (z.B. Temperatur, Druck, pH Wert) und in Anwesenheit eines Biotemplats erlaubt. Verschiedene Biotemplate wie DNA, Bakteriophagen oder Viren werden hierbei eingesetzt. Das Tabak Mosaik Virus (TMV) ist ein  300 nm langes Röhrenförmiges Virus mit einem Durchmesser von 18 nm und einem inneren Kanal mit einem Durchmesser von 4 nm. Dieses Virus wurde als Templat für die Abscheidung von ZnO genutzt und die Form des Virus im Beschichtungsprozess mittels chemical bath deposition (CBD) exakt beibehalten (Abb. 5 und 6). Weiterhin eröffnet die gentechnische Modifikation der Hüllproteine (auf der Oberfläche exprimierte Proteine) große Möglichen die Interaktion zwischen organischem Templat und anorganischem Material zu steuern.

Abb. 6: Querschnitts eines TMV/ZnO
Nanodrahts. HRTEM Bild.

TMV/ZnO Hybridmaterialien wurde erfolgreich zur Herstellung eines Feldeffekt-Transistors (FET) eingesetzt. Diese FETs arbeiten ohne eins sonst übliche Nachbehandlung (z.B. Wärme- oder Strahlungsbehandlung) und zeigt ein gutes Sättigungsverhalten und nur eine geringe Hysteresis.

 



Geförderte Projekte

DFG PAK 410: Biologische Erzeugung von Oxidkeramiken http://www.bionik.uni-stuttgart.de
BI469/15-1
In vitro und in vivo Synthesen von Oxidkeramiken

DFG RO3965/1-1
Identifikation undCharakterisierung con Zirkoniumdioxid-affinen Peptiden zur Mineralisation von Zirkoniumdioxid

SPP 1569: Generation of multifunctional inorganic materials by molecular bionics
http://www.uni-stuttgart.de/spp1569/index.html

BI469/19-1
Genetically optimized Tobacco mosaic viruses as scaffold for the in vitro generation of semiconductor bio/metal oxide nanostructured architectures
http://www.uni-stuttgart.de/spp1569/projects/genetically_optimzed.html

Literatur zum Thema:

Rothenstein, D., Claasen, B., Omiecienski, B., Lammel, P., Bill, J., 2012. Isolation of ZnO-Binding 12-mer Peptides and Determination of Their Binding Epitopes by NMR Spectroscopy. Journal of the American Chemical Society 134, 12547-12556.

Atanasova, P., Rothenstein, D., Schneider, J.J., Hoffmann, R.C., Dilfer, S., Eiben, S., Wege, C., Jeske, H., Bill, J., 2011. Virus-Templated Synthesis of ZnO Nanostructures and Formation of Field-Effect Transistors. Advanced Materials 23, 4918-4922.

Atanasova, P., Weitz, R.T., Gerstel, P., Srot, V., Kopold, P., van Aken, P.A., Burghard, M., Bill, J., 2009. DNA-templated synthesis of ZnO thin layers and nanowires. Nanotechnology 20, 365302.